O que permite diferenciar as bactérias quanto à coloração de Gram?

As bactérias são organismos unicelulares procariontes, ou seja, que possuem apenas uma célula, a qual não apresenta núcleo definido e delimitado por membrana. Esses organismos também apresentam como característica a ausência de organelas membranosas, como aquelas encontradas nas células eucarióticas.

Existe uma grande variedade de bactérias em todo o planeta. Elas podem ser classificadas com base em vários critérios, sendo o mais conhecido aquele que considera a morfologia desses organismos. Além dessa forma de classificação, é possível diferenciar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas.

→ Classificação das bactérias com base na morfologia

As bactérias podem ser classificadas em relação à morfologia em:

• Cocos: Bactérias que apresentam estrutura esférica. Podem ser classificadas em relação ao seu arranjo em: diplococos (agrupamento de dois cocos), tétrades (agrupamento de quatro cocos), sarcina (agrupamento de oito cocos formando uma espécie de cubo), estreptococos (cocos agrupados em cadeias) e estafilococos (cocos agrupados em um arranjo semelhante ao cacho de uva);

• Bacilos: Bactérias que apresentam estrutura em forma de bastão. Podem ser encontradas organizadas em diplobacilos (bacilos agrupados aos pares) ou estreptobacilos (bacilos organizados em cadeias). Podem ocorrer ainda em paliçada, agrupados lado a lado;

• Cocobacilos: Assemelham-se a uma forma de transição entre cocos e bacilos e caracterizam-se por serem bastões muito curtos;

• Espiraladas: Apresentam sua célula em espiral e ocorrem, em sua grande maioria, de forma isolada. Podem ser classificados em espirilos, quando possuem corpo mais rígido e a presença de flagelos, e espiroquetas, que são mais flexíveis e locomovem-se por contrações citoplasmáticas;

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• Vibrião: Assemelha-se a uma vírgula e a espirilos muito curtos;

→ Classificação das bactérias com base na constituição da parede celular

De uma maneira geral, podemos dizer que a parede celular das bactérias é formada basicamente por peptidoglicano e garante a proteção desses organismos, a divisão celular e a manutenção da forma das células. Algumas propriedades da parede celular, no entanto, permitem que as classifiquemos em dois grupos: gram-positivas e gram-negativas.

Para identificar se uma bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, utiliza-se a Coloração de Gram, uma técnica criada por Hans Christian Gram que submete as bactérias a corantes e permite a coloração de sua parede. Veja a seguir as características desse grupo de bactérias:

• Gram-positivas: Na parede celular das bactérias gram-positivas, observa-se uma maior quantidade de peptidoglicano, além da presença de ácidos teicoicos. Essas bactérias, em coloração de Gram, coram-se de azul ou violeta.

• Gram-negativas: A parede celular das bactérias gram-negativas apresenta uma maior complexidade. Existe uma camada com menor quantidade de peptidoglicano e outra membrana externa formada por lipopolissacarídeo. Essas bactérias, em coloração de Gram, coram-se de vermelho.

Existe ainda um grupo de bactérias chamado de micoplasma, o qual não possui parede celular. Assim sendo, elas não se coram com a coloração de Gram.

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Em qualquer bate papo sobre o assunto, sempre tem alguém dizendo que a bactéria tal é gram-positiva e a outra é gram-negativa, mas você sabe o que isso significa de fato? Venha com a gente entender qual a diferença entre elas e por que é importante saber essa classificação.

Bactérias são seres vivos unicelulares (são constituídos somente de uma célula) e procariontes, isto é, não possuem membrana nuclear envolvendo seu material genético. Algumas bactérias são causadoras de doenças, no entanto existem bactérias que possuem grande importância ecológica, como as bactérias fixadoras, que participam do ciclo do nitrogênio, ou as decompositoras, importantes em diversos processos produtivos de alimentos.

Imagem 1 – Estrutura típica de uma bactéria

Existem, porém, algumas particularidades entre as bactérias e a fim de diferenciá-las foi criado o método chamado GRAM.

Chama-se coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, estão a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares.

Christiam Gram notou que as bactérias podiam ser coradas de azul ou vermelho devido à precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.

Os organismos Gram-positivos possuem uma parede celular grossa envolvendo a membrana citoplasmática que é composta por peptideoglicanos e ácidos teicoico.

Imagem 2 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Positiva

Os organismos Gram-negativos possuem uma parede celular mais fina que é envolvida por outra membrana externa, portanto os gram-negativos possuem 2 membranas, a externa difere da interna e contém moléculas de lipopolissacarideos.

Imagem 3 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Negativa

Exemplos de bactérias Gram-positivas

Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Cornyebacterium, Listeria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus.

Exemplos de bactérias Gram-negativas

Escherichia, Helicobcater, Haemophilus, Neisseria, Klebsiella, Enterobacter, Chlamydia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio, Treponema

Por que é importante saber se a bactéria é gram-positiva ou negativa?

É o tipo de parede e portanto, a definição se a bactéria é gram-negativa ou gram-positiva que vai definir a eficácia dos agentes físicos e químicos utilizados para eliminar, controlar ou aumentar o crescimento das bactérias conforme a necessidade. Em food safety, geralmente queremos eliminar ou reduzir as bactérias a quantidades aceitáveis.  Mesmo que nem todas possam ser diferenciadas pela coloração de Gram, com certeza a metodologia tem grande aplicação para food safety.

A técnica de coloração das bactérias ajuda a reconhecer as características de cada caso de infecção e determinar os tratamentos mais convenientes. Cerca de 90 a 95% das bactérias Gram-negativas são patogênicas e muitas Gram-positivas são não patogênicas e algumas, inclusive, são úteis. As paredes mais complexas das bactérias Gram-negativas as tornam mais resistentes e dificultam que os antibióticos e outros medicamentos adentrem em seu interior. Além disso, as bactérias Gram-negativas geralmente são mais ameaçadoras do que as Gram-positivas por terem uma maior virulência e serem ou se tornarem mais facilmente resistentes aos antibióticos. A técnica de Gram tem também uma grande importância clínica porque permite que as bactérias associadas a infecções sejam prontamente caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, o que permite monitorar a infecção e adotar certas opções de tratamento, mesmo antes que seja feita uma cultura.

O peptideoglicano, por exemplo, é o sitio de ação da penicilina, isso explica por que os antibióticos são mais efetivos contra Strepto e Estaphilo (G+) do que contra E. coli (G-), por exemplo.

E como é feita a técnica de Gram?

Quando coloridas por um corante adequado e levadas ao microscópio, pode-se diferenciar dois tipos distintos de bactérias: as chamadas Gram-positivas e as Gram-negativas. Elas são assim chamadas porque foi o médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, quem elaborou o processo de colorir e descolorir as bactérias. Bactérias Gram-positivas são aquelas cujas paredes celulares não perdem a cor azul-arroxeada quando submetidas a um processo de descoloração depois de terem sido coloridas pela violeta de genciana. As que assumem um tom róseo-avermelhado quando submetidas ao mesmo processo são ditas Gram-negativas. Christiam Gram notou que as bactérias podiam se coradas de azul ou vermelho devido a precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.

Por que este método cora algumas bactérias em violeta e outras em vermelho?

Isso ocorre devido às diferenças de estruturas químicas da superfície bacteriana e da composição da parede celular. As bactérias Gram-negativas contêm uma concentração mais elevada de lipídeos, quando comparadas com as Gram-positivas; suas paredes são, também, mais finas do que as paredes celulares de bactérias Gram-positivas. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-cetona extrai os lipídeos, resultando em uma permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente (menor conteúdo de lipídeos), torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-cetona reduzindo a permeabilidade e portanto, o complexo cristal violeta não pode ser extraído.

Passo a passo resumido da metodologia de Gram

1. Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e logo após deixe por aproximadamente 15 segundos;
2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e então deixe agir por mais 45 segundos;
3. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
5. Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave em um filete de água corrente;
9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente com o auxílio de um papel de filtro limpo;
10. Visualize no microscópio. Logo após leia em objetiva de imersão (100 X).

Referências:

• ABCMED, 2014. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas: o que são? Como é a técnica de Gram? Quais as vantagens de diferenciar as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas?. Disponível em: <https://www.abc.med.br/p/587007/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas-o-que-sao-como-e-a-tecnica-de-gram-quais-as-vantagens-de-diferenciar-as-bacterias-gram-negativas-e-gram-positivas.htm>. Acesso em: 3 fev. 2020.
• https://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/
• Ministério da Saúde. Técnica de Coloração de GRAM

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Juliana Barbosa é Médica Veterinária, Mestre e Doutora em Engenheira de Alimentos pela URI Erechim, RS e especialista em Controle de Qualidade e Inspeção de Alimentos. Atuou em indústrias e Universidades nas áreas de Garantia da Qualidade e Inspeção de Alimentos. Administradora da página qualidade de alimentos no Facebook e Instagram.

Qual a diferenciação bacteriana quanto à coloração de Gram?

Como funciona a coloração de Gram para identificação das bactérias?

Quais os principais métodos diferenciais de coloração de bactérias?

Qual o agente diferenciador da coloração de Gram?